株式会社 森永生科学研究所
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応用方法ー短時間測定法

短時間測定法では弊社のレプチン測定キットを用い4時間30分でで検体中のレプチン濃度の測定が可能です。
但し、最終データは標準法で測定することをお勧めいたします。

短時間測定法の特長

  • 通常法との相関性が高いです。
  • レプチン濃度が0.4〜25.6ng/mLの範囲で測定が可能です。
  • 5μL以下の微量な血清(血漿)で測定が可能です。
  • 4時間30分で測定が可能です。

試薬の調製法

  • 試薬はすべて「モリナガレプチン測定キット」の試薬を使用します。
  • 赤文字が通常法と異なります。
注意:この方法はあくまで参考データを得るものです。最終データは標準法で測定することをお勧め致します。

レプチン標準溶液の作製

「B 凍結乾燥レプチン標準品」1バイアルに100μLの「C.検体希釈液」を加えて溶解して下さい。レプチン標準溶液は25.6ng/mLになります。溶解後は直ちに使用してください。測定を2回に分けて行う場合はレプチン標準溶液を使用後直ちに−20℃以下で凍結保存してください。
レプチン標準溶液を「C.検体希釈液」で倍々に希釈し、下記に示しますように0.4ng/mLから25.6ng/mLの標準曲線用レプチン溶液を調製します。0ng/mLレプチンは検体希釈液をそのまま用います。調整後は直ちに使用してください。

操作手順

測定準備 標準曲線用レプチン溶液および検体を用意
 
一次反応 1)プレート用フレームに抗体固相化プレートをセット
2)洗浄液で各ウェルを2回洗浄
3)検体希釈液を45μL/ウェルで分注
4)モルモット抗レプチン抗血清を50μL/ウェルで分注
5)あらかじめ用意した標準曲線用レプチン溶液または検体を5μL/ウェルで添加
6)常温で2時間静置して反応
 
洗浄 300μL/ウェルの洗浄液で5回洗浄
 
二次反応 1)酵素標識抗モルモットIgG抗体溶液を100μL/ウェルで分注
2)常温で2時間静置して反応
 
洗浄 300μL/ウェルの洗浄液で7回洗浄
 
酵素反応 1)酵素基質溶液を100μL/ウェルで分注
2)遮光下常温で30分間静置して反応
 
反応停止 反応停止液を100μL/ウェルで添加
 
吸光度測定 プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定し、検体中のレプチン濃度を求める
吸光度は、反応停止後30分以内に測定してください。

レプチン濃度の算出方法

  1. 二重測定した各ウェルの吸光度の平均値を算出します。
  2. 片対数方眼紙を用いてlog側に標準曲線用レプチン溶液のそれぞれの濃度を、linear側に標準曲線用レプチン溶液のそれぞれの吸光度をプロットし、標準曲線を作成します。
  3. 標準曲線より各検体中のレプチン濃度を読みとります。
標準曲線例はマウスレプチン標準品のものですが、ラットレプチン標準品でも同様に算出できます。
コンピューターソフトで演算処理する場合は、4-paramaterの使用をお勧めします。

通常法との相関性

ラット、マウスとも r=0.998,0.999とよく相関しています。

通常法との相関性

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